抑郁症造模丨慢性社交挫败应激CSDS建模介绍

       在众多抑郁症的实验研究模型中，慢性社交挫败应激（Chronic social defeat stress，简称CSDS）模型因有明显的诱因、较好的建模成功率以及明显的表型呈现而被广泛认可。以常用的啮齿类动物模型为例，其原理是将一只受试动物与另一只具有攻击性的动物放一起，具攻击性的动物会反复、强势攻击受试动物，使其感受社交挫败应激，从而引发一系列类似抑郁的行为，如社交回避行为、蔗糖偏好降低、奖励阈值增加、悬尾试验和强迫游泳试验中不动性状态增加、认知障碍和快速动眼睡眠期异常等。

本文将介绍一个常规的CSDS建模方案：将C57BL/6J小鼠与一只更大、更有攻击性的CD-1小鼠放在一起，从而诱导出C57BL/6J小鼠的抑郁样综合征（以其在社交方面的持久障碍如社交回避为特征）。该方案整个实验进程需要3 - 4周完成，包含三个重要阶段：

1. 攻击性CD-1小鼠的筛选阶段；
2. C57BL/6J小鼠社交挫败（Social defeat）阶段；
3. C57BL/6J小鼠社交（Social interaction，简称SI）检测阶段。

01

实验材料

1.矩形大鼠饲养笼（长48.3 cm × 宽26.7 cm × 高15.2 cm）；

2.多孔的隔离挡板（长45.7 cm × 宽0.6 cm × 高15.2 cm）；

3.视频追踪设备和软件（可用Panlab的Smart V3.0软件）；

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4.非透明的旷场（侧壁包含可拆卸的有机玻璃罩，用于社交测试）；

02

实验动物

CD-1小鼠（30-50只）、C57BL/6J小鼠（50-80只）

03

实验设计

筛选阶段（实验时间为3天）

1. 购买4-6个月龄的非繁育CD-1雄性小鼠，实验前将CD-1小鼠单笼饲养7天以适应环境。（单笼饲养是为了培养并保持CD-1小鼠的攻击性，也可通过将CD-1小鼠与2只雌鼠放置3-4天后再拿出以培养其攻击性）
2. 购买一大批C57BL/6J小鼠（年龄6-7周最佳），从其中选取一批鼠（可被反复用于后续的筛选），专门用于筛选CD-1攻击鼠。
3. 对于单只CD-1小鼠的筛选而言，整个筛选过程持续3天，每天1次，每天将1只C57BL/6J小鼠放入CD-1小鼠的饲养笼中，持续3分钟后再拿出；每天换不同的C57BL/6J小鼠试验共进行3天。筛选标准：在三天的3分钟筛选过程中，CD-1小鼠必须在至少连续两天对C57BL/6J小鼠有攻击行为；且初次攻击的潜伏期在1分钟内。

社交挫败（Social defeat）阶段（实验时间为10天）

1. 提前一天将社交挫败实验笼（含垫料）准备好，并提前一晚将筛选出的CD-1小鼠放置于隔离挡板的一侧笼子中；（共需10只不同的筛选好的CD-1小鼠，每天准备1只）
2. 实验组：对于单只受试C57BL/6J小鼠而言，需接受连续10天的社交挫败应激实验，每天持续5-10分钟。每一天，将受试的C57BL/6J小鼠直接放置于准备好的含CD-1小鼠的那一侧实验笼中经历5-10分钟的社交对抗，此过程称之为直接接触应激。之后，将C57BL/6J小鼠放置到实验笼的隔离挡板的另一侧，放置24小时作为间接心理应激。此过程每只受试的C57BL/6J小鼠将每天面临1只不同的CD-1小鼠，连续重复上述操作10天。（对于单只CD-1小鼠而言，每天可面临多只C57BL/6J小鼠，取决于每组受试动物的只数）注意事项：实验过程应密切观察，以确保高质量的攻击行为正常发生。高质量的攻击行为需满足在实验的5-10分钟内，攻击行为持续且周期性发生；每分钟不少于1回合的攻击，每回合持续时间约5-10秒。若出现两只动物互相理毛的现象，视为该阶段实验失败。

3. 对照组：选取2只同年龄段C57BL/6J小鼠，参照实验组的实验（可以理解为将实验组中的CD-1小鼠替换为对照C57BL/6J小鼠），每天更换不同的实验笼，连续重复此操作10天。注意事项：实验过程应密切观察，避免两只小鼠发生肢体冲突。10天的社交挫败实验结束后，将所有的受试C57BL/6J小鼠单独饲养，24小时后（或根据实验设计时间）进行后续的社交检测阶段。

社交（Social interaction，简称SI）检测阶段（实验时间为1天）

1. 准备社交检测需要的旷场，摄像系统以及视频分析软件；
2. 视频记录：分别将受试C57BL/6J小鼠（对照组和实验组）依次单只放入社交旷场中，检测之前先让其适应环境1小时；之后继续实验进入视频记录阶段，开启摄像系统记录C57BL/6J小鼠在旷场中的轨迹追踪：先做2.5分钟的无CD1-1小鼠的轨迹追踪；中间间隔30秒，同时在旷场侧壁的有机玻璃罩内放入一只全新的攻击性CD1-1小鼠（此只小鼠在社交挫败阶段没被用过）；再做2.5分钟有CD1-1小鼠后的轨迹追踪。软件记录并分析该实验检测的指标，主要如下：a. 动物整体的轨迹以及总行程；b. 动物进入不同区域（主要是社交区域，角落区域根据需要进行记录）的次数以及停留时间。
3. 数据分析：通过软件记录相关指标之后，有两种数据分析方法：

根据软件的记录分析结果，直接比较放了CD1-1小鼠以及未放CD1-1小鼠的两个2.5分钟中，C57BL/6J小鼠分别在社交区域花的时间，分别定义为T1和T2；

计算放置和未放置CD1-1小鼠的两种情况下，C57BL/6J小鼠分别在社交区域花的时间比值，即T1/T2，被定义为SI比值，以SI比值等于1为分析标准。

理想状态下，由于动物的探索天性，在对照组的数据中，T1会大于T2，或者SI比值会大于1；而在实验组中，由于小鼠经受前期的社交挫败阶段，会对同类型的CD1-1小鼠产生社交回避，即出现T1小于T2或者SI比值小于1的数据。

然而在实际实验中，实验组的数据可能会指示受试C57BL/6J小鼠的两种亚型：一组鼠的数据和对照鼠更接近，我们称之为不易感小鼠，而另一组鼠表现和对照组有明显差异，被称之为易感小鼠。这两种亚型的划分对于一些疾病模型（如创伤后应激障碍）的研究有重要意义。

04

注意事项

1. 要确保每次实验时CD-1小鼠的攻击性。理论上通过筛选标准的CD-1小鼠可以使用3个月，进行3次CSDS模型的建立，但是在每一次新的模型建立前都需要再重新筛选一次。
2. 保持C57BL/6J小鼠保持7-8周龄时做社交挫败实验最佳，年龄过大（大于20周）的小鼠会降低社交挫败的效果。
3. 社交挫败实验可能使得受试动物形成外伤。对于本实验而言，外伤并不是必要的，而且长期的暴露性外伤会影响受试动物的后续评估。可采取的措施有：缩短社交挫败阶段的持续时间，或者适当地移除攻击性的CD-1小鼠。
4. 在单批次的10天社交挫败阶段造模结束后，应对整套实验笼具进行灭菌消毒并擦干，防止气味残留对下一批实验数据造成干扰。

【文献引用】

1.Golden, S. A., Covington, H. E., 3rd, Berton, O. & Russo, S. J. A standardized protocol for repeated social defeat stress in mice. Nat Protoc 6, 1183-1191, doi:10.1038/nprot.2011.361 (2011).

2.Kim, H.-D., Call, T., Carotenuto, S., Johnson, R. & Ferguson, D. Testing Depression in Mice: a Chronic Social Defeat Stress Model. Bio-Protocol 7, doi:10.21769/BioProtoc.2203 (2017).

3.Krishnan, V. et al. Molecular adaptations underlying susceptibility and resistance to social defeat in brain reward regions. Cell 131, 391-404, doi:10.1016/j.cell.2007.09.018 (2007).